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A videira (Vitis vinifera L.) é considerada uma das primeiras espécies agrícolas a ser domesticada, cuja história está intimamente ligada ao desenvolvimento da cultura humana. A contribuição de diferentes pools génicos, resultantes do longo processo de cultivo e disseminação da videira, levou ao aparecimento de uma considerável diversidade genotípica. No entanto, essa diversidade tem sofrido reduções drásticas nos últimos anos, devido a diversos stresses bióticos e abióticos. Tendo em conta que a variação genética é a chave para a existência de variedades mais capazes de se adaptar aos referidos stresses, um esforço internacional para a preservação da videira tem vindo a ser desenvolvido. Inúmeras acções de preservação dos recursos genéticos de videira são realizadas por todo o mundo vitícola, através da prospecção, caracterização, manutenção e troca de castas tradicionalmente cultivadas em cada região. Mais particularmente, várias estratégias para a conservação in situ e ex situ do pool génico da videira podem ser delineadas de modo a fazer perdurar este germoplasma valioso, no presente e para o futuro. É importante extrapolar para a utilização de ferramentas moleculares e biotecnológicas, com o intuito de garantir a preservação do germoplasma de videira. Asim sendo, 3 estratégias principais foram desenvolvidas no presente trabalho. A primeira estratégia consistiu em prospectar e caracterizar, através de marcadores moleculares, 310 amostras de V. vinifera em 11 vinhas velhas e que foram consideradas como constituir uma ampla representação do património genético em videira das regiões vitivinícolas do "Douro" e "Trás-os-Montes". A estrutura populacional dos 65 genótipos não redundantes identificados foi também avaliada, genótipos esses que foram divididos em 2 grupos genéticos ancestrais. Os valores médios da probabilidade de identidade de 0,072 e 0,510 (para os 6 SSR e 226 SNP, respectivamente) foram calculados. Os haplótipos cloroplastidiais foram determinados através da amplificação de marcadores cloroplastidiais: pequenas diferenças foram observadas entre as frequências dos clorótipos A e D nos genótipos não redundantes estudados. As relações de parentesco foram igualmente inferidas, com 27 pedigrees confirmados e 9 novos trios estabelecidos; contudo, os ancestrais de 8 genótipos permanecem desconhecidos. Numa segunda estratégia, foi necessário avaliar a ausência / presença de 4 vírus economicamente importantes - Grapevine fanleaf virus (GFLV), Arabis mosaic virus (ArMV) e Grapevine leafroll - associated viruses 1 e 3 (GLRaV-1 e -3) -, através de ELISA, em 98 videiras seleccionadas em 3 locais de amostragem das regiões “Douro” e “Vinho Verde”. As plantas de 17 castas colhidas na região “Douro” mostraram ser saudáveis, mas uma alta incidência de GLRaV-3 em clones de 6 variedades da região dos “Vinhos Verdes” - 'Batoca', 'Esganoso', 'Espadeiro', ‘Lameiro', ‘Padeiro' e 'Pintosa’ - foi detectada. Procedeu-se a'Esganoso', 'Espadeiro', ‘Lameiro', ‘Padeiro' e 'Pintosa’ - foi detectada. Procedeu-se a i erradicação de GLRaV-3 através da cultura in vitro e de termoterapia. A combinação da cultura in vitro com a termoterapia in vivo permitiu a obtenção de 35,42% de plântulas isentas de GLRaV-3. No entanto, nenhuma eliminação viral foi alcançada em plântulas in vitro derivadas de plantas-mãe que apresentavam um maior grau de virulência, mesmo tendo realizado termoterapia in vivo. A terceira estratégia envolveu a avaliação de diferentes metodologias in vitro de crescimento lento como estratégias de preservação da videira, uma vez que a conservação in vitro é um complemento interessante para a manutenção dos recursos genéticos de videira. Previamente à realização desses ensaios de conservação in vitro, foram obtidas plântulas in vitro e calli embriogénico, através do estabelecimento in vitro de segmentos nodais e indução de embriogénese somática (ES) de 'Preto Martinho', 'Malvasia Preta', 'Cornifesto', 'Touriga Nacional', 'Tinto Cão’, 'Pinot Noir’, '549862', 'Alfrocheiro-549865' e 'Trincadeira-549867'. Assim, 3 ensaios de conservação in vitro foram avaliados: i) meios de cultura com reduzidas concentrações de macro- e micronutrientes (i.e. meios mínimos); ii) meios mínimos com diferentes concentrações de hidratos de carbono (sacarose, manitol ou sorbitol); iii) manutenção de gomos apicais encapsulados a baixa temperatura. A influência desses métodos de crescimento lento no crescimento de explantes e na sua sobrevivência de 'Pinot Noir', 'Touriga Nacional', 'Cornifesto', 'Preto Martinho' e 'Malvasia Preta’, 'Alfrocheiro-549865', 'Trincadeira-549867' e '549862' foram determinados até aos 300 dias de cultura in vitro. Em relação aos ensaios de meios mínimos, os meios de cultura com sais reduzidos a metade (MM-5 e MM-1) foram considerados como os mais adequados num período de conservação de 180 dias, com taxas de sobrevivência dos explantes acima de 75%, e subsequente crescimento de novas plântulas em 6 das castas / genótipos estudados; em ‘Malvasia Preta’ e ‘549862’, os meios controlo permaneceram os mais adequados para a sua conservação. Relativamente aos meios mínimos com diferentes concentrações de sais e sacarose ou sorbitol, os meios mais eficazes após 180 dias de conservação e subsequente crescimento de novas plântulas, além do meio controlo, foram: meio com sais MS, suplementado com sacarose a 4,0% (p/v; Suc-1) e meio com sais MS/2 com sorbitol a 1,0% (p/v; Srb-4) em 'Preto Martinho'; e meios com sais NN, suplementado com sacarose a 2,5% (p/v; Suc-9) e meio NN com sorbitol a 1,0% (p/v; Srb-10) em ‘Pinot Noir’. Nos ensaios de manutenção de gomos apicais encapsulados a baixa temperatura, o tratamento Cold-90 combinou os melhores resultados para ‘Pinot Noir’, ‘Cornifesto’ e ‘Preto Martinho’ após 150 dias de conservação, com 70,00 - 100% dos explantes vivos. O tratamento Cold-60 combinou os melhores dados para ‘Touriga Nacional’, ‘Malvasia Preta’ e ‘Trincadeira-549867’, pois 60,00-87,00% dos explantes sobreviveram. Em Alfrocheiro-549865’, as maiores percentagens de sobrevivência foram registadas nos tratamentos Cold-60 e Cold-90, mas apenas 67,00% dos explantes sobreviveram. Em '549862', a maior taxa de sobrevivência de explantes foi alcançada no tratamento Cold-30, com 90,00% dos explantes vivos. Além disso, como o material vegetal em condições in vitro é exposto a diversos stresses que podem induzir variação somaclonal, citometria de fluxo e inter-microssatélites (ISSR) foram utilizados para avaliar a estabilidade genética de plântulas de 'Pinot Noir', 'Touriga Nacional', 'Cornifesto', 'Malvasia Preta’, 'Preto Martinho’, '549862', 'Alfrocheiro-549865' e 'Trincadeira-549867', derivadas de ES e ensaios de conservação in vitro. A avaliação da homogeneidade genética por citometria de fluxo mostrou que 97,60% das plântulas derivadas de ES eram diplóides, sendo os outros 2,40% representados por plântulas tetraplóides de ‘Touriga Nacional’ e ‘Cornifesto’. Todas as plântulas analisadas, resultantes dos ensaios de conservação a 300 dias nas mesmas condições de cultura in vitro, mantiveram estáveis os seus níveis de ploidia. Oito loci ISSR foram eficientemente usados, de modo a determinar que 100% das plântulas in vitro amostradas eram geneticamente homogéneas. Os resultados obtidos sugerem que os protocolos de regeneração de plantas através de ES e protocolos de conservação in vitro, recorrendo a meios mínimos com diferentes concentrações de sais e agentes osmóticos, podem ser aplicados para a preservação de videira com baixo risco de instabilidade genética. A implementação destas estratégias moleculares e biotecnológicas pretende assim contribuir para a conservação dos recursos genéticos de videira, visto que a preservação do seu pool génico é de uma importância fundamental para o sucesso de uma viticultura sustentável e rentável. |
| Description (Translated): |
Grapevine (Vitis vinifera L.) is considered one of the first crops to be domesticated, having ancient historical connections with the development of the human culture. The contribution of different gene pools in the process of grapevine long cultivation and spreading has resulted in the development of an important and huge genotypic diversity. However, in the recent past, a drastic reduction of these grape diversity was observed due to several biotic and abiotic stress. Since genetic variation is the key to the emergence of better-adapted varieties capable of facing the referred challenges, an international endeavour aiming the grapevine preservation has been undertaken. Numerous efforts to preserve the grape genetic resources are been carried out all over the viticultural world, through prospection, characterisation, maintenance and exchange of varieties traditionally cultivated in each region. More particularly, several strategies for in situ and ex situ grapevine gene pool conservation can be delineated to maintain this still existing and valuable grape germplasm in the present and for the future. It is important to extend the use of molecular and biotechnological tools to ensure the preservation of the existing grape germplasm. In this sense, 3 main strategies were developed in the present research work. The first strategy was to prospect and characterise, through molecular markers, 310 V. vinifera samples of 11 old vineyards that were considered to constitute a broad representation of the grape genetic patrimony of "Douro" and "Trás-os-Montes" wine regions. The population structure among the 65 non-redundant genotypes identified was also evaluated, which were assigned into 2 ancestral genetic groups. The mean probability of identity values of 0.072 and 0.510 (for the 6 SSR and 226 SNP sets, respectively) were calculated. Grape chloroplastidial haplotypes were determined through amplification of chloroplastidial markers; minor differences were observed between frequencies of chlorotypes A and D within the non-redundant genotypes studied. Kinship relationships were also inferred, with 27 pedigrees confirmed and 9 new trios established; however, ancestors of 8 genotypes remain unknown. In a second strategy, it was necessary to assess the absence / presence of 4 economical important viruses - Grapevine fanleaf virus (GFLV), Arabis mosaic virus (ArMV) and Grapevine leafroll - associated viruses 1 and 3 (GLRaV-1 and -3) -, through ELISA, in 98 selected grapevines sampled in 3 locations at “Douro” and from “Vinho Verde” regions. Surveys performed have shown healthy plants from 17 grape varieties collected at “Douro” region, but a high incidence of GLRaV-3 in distinct clonal plants from 6 “Vinhos Verdes” varieties - ‘Batoca’, ‘Esganoso’, ‘Espadeiro’, ‘Lameiro’, ‘Padeiro’ and ‘Pintosa’. The eradication of GLRaV-3 was attempted through in vitro culture with preceding temperaturebased approaches. Combining in vitro culture with in vivo thermotherapy allowed to obtain v 35.42% of GLRaV-3-free plantlets. However, no sanitation was attained in in vitro-grown plantlets derived from mother plants with higher degrees of virulence, even with in vivo thermotherapy performed. The third strategy was to evaluate different in vitro slow growth methodologies as tools to preserve the grapevine, since in vitro conservation is an interesting complement for the maintenance of grape genetic resources. Prior to perform these conservation assays, in vitro-grown plantlets and embryogenic calli were obtained, through in vitro establishment of nodal cultures and somatic embryogenesis (SE) induction of ‘Preto Martinho’, ‘Malvasia Preta’, ‘Cornifesto’, ‘Touriga Nacional’, ‘Tinto Cão’, ’Pinot Noir’, ‘549862’, ‘Alfrocheiro-549865’ and ‘Trincadeira-549867’. Three conservation experiments were assessed: i) culture media with reduced salt concentrations (i.e. minimal media); ii) minimal media with different carbohydrate (sucrose, mannitol or sorbitol) concentrations; iii) shoot-tip encapsulation with low-temperature storage. The influence of these slow growth procedures on explant growth and survival of ‘Pinot Noir’, ‘Touriga Nacional’, ‘Cornifesto’, ‘Preto Martinho’ and ‘Malvasia Preta’ varieties and ‘Alfrocheiro-549865’, ‘Trincadeira-549867’ and ‘549862’ genotypes was determined until 300 days of in vitro culture. Concerning culture media with reduced salt concentrations experiment, media with half-strength salts (MM-5 and MM-1) were evaluated as the most suitable for a 180-day conservation period, with explants survival above 75%, and subsequent plantlet regrowth among 6 grapevines studied; in ‘Malvasia Preta’ and ‘549862’, control medium were still the most suitable for their germplasm conservation. Regarding to media with different concentrations of salts and sucrose or sorbitol, the most effective media after 180 days of conservation and subsequent plantlet regrowth besides control medium, are: media with full-strength MS salts and 4.0% (w/v) sucrose (Suc-1) and media with half-strength MS salts with 1.0% (w/v) sorbitol (Srb-4) for ‘Preto Martinho’; and full-strength NN salts and 2.5% (w/v) sucrose (Suc-9) and full-strength NN media with 1.0% (w/v) sorbitol (Srb-10) for ‘Pinot Noir’. In shoot-tip encapsulation with low temperature storage methodology, Cold-90 treatment combined the best results for ‘Pinot Noir’, ‘Cornifesto’ and ‘Preto Martinho’ after 150 days of conservation, since 70.00 - 100% of explants are alive. Cold-60 treatment combined the best data for ‘Touriga Nacional’, ‘Malvasia Preta’ and ‘Trincadeira-549867’, as 60.00-87.00% of explants survived. In Alfrocheiro-549865’, the highest survival percentages were registered on both Cold-60 and Cold-90 treatments, but just above 67.00% of explants survived. In ‘549862’, the highest explants survival rate was attained on Cold-30 treatment, with 90.00% of explants alive. Moreover, since plant material is exposed to several stress in in vitro conditions that may induce somaclonal variation, flow cytometry and ISSR markers were used to assess the genetic stability of ‘Pinot Noir’, ‘Touriga Nacional’, ‘Cornifesto’, ‘Malvasia Preta’, ‘Preto Martinho, ‘549862’, ‘Alfrocheiro-549865’ and ’Trincadeira-549867’ plantlets, which derived from SE and in vitro conservation assays. Evaluation of the genetic homogeneity by flow vi cytometry showed that 97.60% of the SE-derived plantlets were diploid, being the other 2.40% represented by ‘Touriga Nacional’ and ‘Cornifesto’ tetraploid plantlets. All the analysed regrown plantlets which were submitted to a 300-day conservation period in the same culture conditions maintained stable their DNA ploidy level. Eight ISSR loci were also efficiently used for determining that 100% of the in vitro-grown plantlets were true-to-type. Results obtained suggest that the proposed plant regeneration protocols through SE and in vitro conservation protocols using minimal media with different salts and osmotic agents concentrations could be used for the grapevine preservation with less risk of genetic instability. The implementation of these molecular and biotechnological strategies intended to contribute to the grapevine genetic resources conservation, since preserving the grape gene pool is of crucial importance in the success of a sustainable and profitable viticulture. |