Electronic Resource
Fractionation of Enriched Phosphopeptides Using pH/Acetonitrile-Gradient-Reversed-Phase Microcolumn Separation in Combination with LC-MS/MS Analysis
| العنوان: | Fractionation of Enriched Phosphopeptides Using pH/Acetonitrile-Gradient-Reversed-Phase Microcolumn Separation in Combination with LC-MS/MS Analysis |
|---|---|
| Additional Titles: | Frakcionace obohacených fosfopeptidů s využittím separace na mikrokoloně pomocí pH/acetonitril-reverzně fázového gradientu v kombinaci s LC-MS/MS analýzou |
| المؤلفون: | Ondrej, Martin, Řehulka, Pavel, Řehulková, Helena, Kupčík, Rudolf, Tichý, Aleš |
| بيانات النشر: | MDPI 2021-05-15T18:48:29Z 2021-05-15T18:48:29Z 2020 |
| نوع الوثيقة: | Electronic Resource |
| مستخلص: | Mass spectrometry (MS) is a powerful and sensitive method often used for the identification of phosphoproteins. However, in phosphoproteomics, there is an identified need to compensate for the low abundance, insufficient ionization, and suppression effects of non-phosphorylated peptides. These may hamper the subsequent liquid chromatography-mass spectrometry/mass spectrometry (LC-MS/MS) analysis, resulting in incomplete phosphoproteome characterization, even when using high-resolution instruments. To overcome these drawbacks, we present here an effective microgradient chromatographic technique that yields specific fractions of enriched phosphopeptides compatible with LC-MS/MS analysis. The purpose of our study was to increase the number of identified phosphopeptides, and thus, the coverage of the sample phosphoproteome using the reproducible and straightforward fractionation method. This protocol includes a phosphopeptide enrichment step followed by the optimized microgradient fractionation of enriched phosphopeptides and final LC-MS/MS analysis of the obtained fractions. The simple fractionation system consists of a gas-tight microsyringe delivering the optimized gradient mobile phase to reversed-phase microcolumn. Our data indicate that combining the phosphopeptide enrichment with the microgradient separation is a promising technique for in-depth phosphoproteomic analysis due to moderate input material requirements and more than 3-fold enhanced protein identification. Hmotnostní spektrometrie (MS) je výkonná a citlivá metoda, která je často využívána k identifikaci fosfoproteinů. Ve fosfoproteomice však byla zjištěna potřeba kompenzovat jejich malou abundanci, nedostatečnou ionizaci a potlačující efekt nefosforylovaných peptidů. To může bránit následné analýze pomocí kapalinové chromatografie a hmotnostní spektrometrie/hmotnostní spektrometrie (LC-MS/MS), což vede k neúplné charakterizaci fosfoproteomu, i když se používají přístroje s vysokým rozlišením. Abychom překonali tyto nevýhody, je zde předkládána efektivní chromatografická technika s mikrogradientem, která poskytuje specifické frakce obohacených fosfopeptidů přímo kompatibilních s LC-MS/MS analýzou. Účelem naší studie bylo zvýšit počet identifikovaných fosfopeptidů, a tím i pokrytí fosfoproteomu v analyzovaném vzorku pomocí reprodukovatelné a přímé metody frakcionace. Tento protokol zahrnuje krok obohacení fosfopeptidů, po kterém následuje optimalizovaná mikrogradientní frakcionace obohacených fosfopeptidů a konečná LC-MS/MS analýza získaných frakcí. Jednoduchý frakcionační systém se skládá z plynotěsné mikrostříkačky sloužící k tlačení optimalizovaného gradientu mobilní fáze do mikrokolony s reverzní fází. Naše data ukazují, že kombinace obohacení fosfopeptidů s mikrogradientní separací je slibnou technikou pro hloubkovou fosfoproteomickou analýzu i díky nenáročným požadavkům na vstupní materiál a navíc poskytuje více než trojnásobně lepší identifikaci proteinů. |
| مصطلحات الفهرس: | phosphopeptides, fractionation, acetonitrile, gradient, enrichment, mass spectrometry, titanium dioxide, fosfopeptidy, frakcionace, acetonitril, obohacení, hmotnostní spektrometrie, oxid titaničitý, article |
| URL: | International Journal of Molecular Sciences, volume 21, issue: 11 |
| الاتاحة: | Open access content. Open access content open access (CC BY 4.0) https://creativecommons.org/licenses/by/4.0 |
| ملاحظة: | p. 3971 application/pdf English |
| Other Numbers: | CZPAR oai:dk.upce.cz:10195/77366 1661-6596 10.3390/ijms21113971 000543400300233 2-s2.0-85085895215 39885095 1262991492 |
| المصدر المساهم: | UNIV LIBR OF THE UNIV OF PARDUBICE From OAIster®, provided by the OCLC Cooperative. |
| رقم الانضمام: | edsoai.on1262991492 |
| قاعدة البيانات: | OAIster |
| الوصف غير متاح. |