Comparative proteomic analysis of the effect of mechanical stretch on phosphatidylcholine metabolism of human lung cells
| العنوان: | Comparative proteomic analysis of the effect of mechanical stretch on phosphatidylcholine metabolism of human lung cells |
|---|---|
| المساهمون: | Λέκκα, Μαρία-Ελένη, Πάνου, Ευγενία, Λεονταρίτης, Γεώργιος |
| بيانات النشر: | Πανεπιστήμιο Ιωαννίνων. Σχολή Θετικών Επιστημών. Τμήμα Χημείας, 2017. |
| سنة النشر: | 2017 |
| مصطلحات موضوعية: | Φωσφατιδυλοχολίνη, Πρωτεομική ανάλυση, Phosphatidylcholine (PC), Αναπνευστικό σύστημα, Proteomic analysis, Cyclic mechanical stretch, Κυκλική μηχανική διάταση |
| الوصف: | Η φωσφατιδυλοχολίνη (PC) αποτελεί το κυριότερο φωσφολιπιδικό συστατικό του επιφανειοδραστικού παράγοντα των πνευμόνων. Βιοσυντίθεται μέσω μίας denovoπορείας (πορεία Kennedy), το καθοριστικό και ρυθμιστικό στάδιο της οποίας καταλύεται από το ένζυμο CTP: φωσφοχολινοκυτιδυλοτρανσφεράση (CCT). Η PCμετατρέπεται σε διπαλμιτοϋλοφωσφατιδυλοχολίνη (DPPC) ακολουθώντας δύο στάδια αναδιαμόρφωσης και καταβολίζεται παράγοντας χολίνη και άλλους μεταβολίτες. Ο σκοπός αυτής της εργασίας εστιάζεται στη διερεύνηση της επίδρασης της μηχανικής διάτασης στη γονιδιακή και πρωτεϊνική έκφραση του ρυθμιστικού ενζύμου του μεταβολισμού της PC, CCT, και συγκεκριμένη της α ισομορφής της (CCTα), η οποία κωδικεύεται από το γονίδιο PCYT1A. Μελετήθηκε, επίσης, η πρωτεϊνική έκφραση των ενζύμων που συμμετέχουν σε πορείες που σχετίζονται με το μεταβολισμό της PC.Για το σκοπό αυτό χρησιμοποιήθηκε η κυτταρική σειρά Α549, ως μοντέλο μελέτης των πνευμονοκυττάρων τύπου ΙΙ. Συγκεκριμένα: 1) Μελετήθηκε η γονιδιακή έκφραση του ρυθμιστικού ενζύμου με τη βοήθεια της ποσοτικής RT-PCR μετά από εφαρμογή δύο συνθηκών κυκλικής μηχανικής διάτασης 15% και 25%, χρονικής διάρκειας 1 h, 6 h και 24 h. Όσον αφορά τη πρωτεϊνική έκφραση του ενζύμου, η μελέτη της πραγματοποιήθηκε με τη βοήθεια της πρωτεομικής ανάλυσης μετά από εφαρμογή δύο συνθηκών κυκλικής μηχανικής διάτασης 15% και 25%, χρονικής διάρκειας 24 h. 2) Μελετήθηκε η επίδραση της μηχανικής διάτασης 15% και 25%, διάρκειας 24 hστις πρωτεΐνες που συμμετέχουν στη βιοσύνθεση, την αναδιαμόρφωση και τον καταβολισμό της PC, στο μεταβολισμό του αραχιδονικού οξέος και των λιπαρών οξέων, την πορεία γλυκόλυσης/γλυκονεογένεσης και τον κύκλο του Krebsκαι στις πρωτεΐνες που σχετίζονται άμεσα με την απόκριση των κυττάρων Α549 στο μηχανικό ερέθισμα. Τα ευρήματα της μελέτης συνοψίζονται στα εξής: Η εφαρμογή κυκλικού stretch 15%, διάρκειας 1h , 6 h και 24 h στα κύτταρα Α549 οδήγησε στη μειωμένη γονιδιακή έκφραση του ρυθμιστικού ενζύμου, CCTα, ενώ στην περίπτωση του κυκλικού stretch 25% παρατηρήθηκε επαγωγή της γονιδιακής έκφρασης του ενζύμου μετά από 6 hέως και τις 24 h. Σε επίπεδο πρωτεΐνης πρατηρήθηκε μειωμένη έκφραση του ρυθμιστικού ενζύμου μετά από την εφαρμογή και των δύο συνθηκών κυκλικής μηχανικής διάτασης, 15% και 25%, διάρκειας 24 h. Το κυκλικό stretch επηρέασε κυρίως τα ένζυμα που συμμετέχουν στον καταβολισμό της PC, αυξάνοντας τα επίπεδα έκφρασή τους. Επίσης, παρατηρήθηκε επαγωγή της έκφρασης των ενζύμων που καταλύουν τις αντιδράσεις παραγωγής λευκοτριενίων και πρασταγλανδινών κατά το μεταβολισμό του αραχιδονικού οξέος, καθώς και σχεδόν όλων των πρωτεϊνών που συμμετέχουν στο μεταβολισμό των λιπαρών οξέων, τη γλυκολυτική πορεία και τον κύκλο του Krebs. Τέλος, παρατηρήθηκαν μεταβολές σε πρωτεΐνες που εμπλέκονται στη μεταγωγή σήματος μετά την εφαρμογή του μηχανικού ερεθίσματος. Συμπεραίνουμε ότι η αναστολή της έκφρασης της CCTαέχει ως αποτέλεσμα τη μείωση του ρυθμού σύνθεσης της PC και ότι η εφαρμογή μηχανικής διάτασης μπορεί να ρυθμίσει τα επίπεδα της PC με τη συμμετοχή του ρυθμιστικού ενζύμου CCTα. Phosphatidylcholine (PC) is the major phospholipid component of lung surfactant. It is biosynthesized via a de novo (Kennedy) pathway, which is regulated by choline-phosphate cytidylyltransferase (CCT). PC is converted into dipalmitoyl-PC (DPPC) through two remodeling steps. PC is also catabolized to generate choline and other metabolites. Our work mainly focuses on the effect of cyclic stretch on gene and protein expression of CCT, and specifically its major isoform, CCTα. It was also investigated the expression of all proteins involved in pathwaysrelated to PC metabolism. For this purpose, we used the human alveolar epithelial cell line A549, as a model of type II pneumocytes. Specifically: 1) A549 cells were subjected to two different magnitudes of cyclic stretch, 15% and 25% from 1 h to 24 h. Total RNA preparations and cell homogenates were used for qRT-PCR and proteomic analysis respectively. PCYT1A gene expression was assessed by qRT-PCR after 1 h, 6 h and 24 h of cyclic stretch, while proteomic analysis was performed after 24 h of cyclic stretch. 2) we studied the impact of two different magnitudes of cyclic stretch, 15% and 25%, after 24 h on all proteins involved in PC biosynthesis, remodeling and catabolism, on arachidonic and fatty acid metabolism, on glycolysis/gluconeogenesis pathway, Krebs cycle as well as proteins related to respose to mechanical stimulus. We found that the cyclic stretch 15% we subjected on A549 cells resulted in a gradual reduction in PCYT1A gene expression from 1 h to 24 h, while in the case of the cyclic stretch 25%, we observed an increase after 6 h up to 24 h. We also found a reduction in CCTαprotein levels following both 15% and 25% cyclic stretch, 24 h. It was demonstrated that catabolic pathways of PC were more affected by cyclic stretch. An induction of the enzymes that catalyze the production of leukotrienes and prostaglandins in arachidonic acid metabolism was noticed. There was a similar effect on most of the proteins involved in fatty acid metabolism, glycolysis pathway and Krebs cycle. Finally, both magnitudes of cyclic stretch alter the levels of the proteins related to response to mechanical stimulus. Our findings suggest that the inhibition of CCTαexpression reduced the biosynthetic rate of PC and that cyclic stretch can regulate PC levels through the involvement of CCT. 148 σ. |
| اللغة: | Greek, Modern (1453-) Greek |
| URL الوصول: | https://explore.openaire.eu/search/publication?articleId=od_____10561::ca71ac663cceebeb26c3892bfe1416e8 https://olympias.lib.uoi.gr/jspui/handle/123456789/27907 |
| Rights: | OPEN |
| رقم الانضمام: | edsair.od.....10561..ca71ac663cceebeb26c3892bfe1416e8 |
| قاعدة البيانات: | OpenAIRE |
| الوصف غير متاح. |