| الوصف: |
In Metabolic Engineering werden Stämme generiert, die bestimmte Stoffwechselprodukte überproduzieren. Dazu werden bestehende Stoffwechselwege von jeglicher transkriptioneller, translationeller und post-transkriptioneller Regulation befreit, was dazu führt, dass beteiligte Enzyme in hoher Anzahl vorliegen und unabhängig der Konzentration des Endprodukts aktiv sind. Eine komplette Deregulation eines Stoffwechselweges ist allerdings auch problematisch: Eine Reaktion auf interne oder externe Störungen ist häufig nicht möglich und der Gesamtmetabolismus überfordert mit der Überproduktion eines bestimmten Metaboliten, was dazu führt, dass die zelluläre Fitness reduziert wird und Wachstumsraten abnehmen. Um dieses Problem zu lösen, kann es hilfreich sein, neue Regulationsmechanismen in das metabolische Netzwerk und im Besonderen in den Überproduktions-Stoffwechselweg einzuführen. Bisher wurde dazu in der Regel vor allem die Enzymproduktion neu reguliert. Ein Beispiel dafür sind Zwei-Phasen-Bioprozesse, welche unterteilt sind in eine Wachstumsphase, in der ausreichend Biomasse akkumuliert wird, und eine Produktionsphase, in welcher die für die Überproduktion benötigten Enzyme hergestellt und gegebenenfalls Flüsse in konkurrierende Stoffwechselwege blockiert werden. Allerdings erlaubt eine Regulation der Enzymmenge keine schnelle Regulation innerhalb von Sekunden oder Minuten, was insbesondere in großen Bioreaktoren wichtig wäre, da unzureichende Vermischungen hier dazu führen, dass die Verfügbarkeit von Nährstoffen und Sauerstoff sehr stark schwanken kann. Dies kann zur Bildung von Bereichen innerhalb des Bioreaktors mit nur geringer Nährstoffversorgung, so genannter dead zones, führen. Zellen, in denen der Überproduktions-Stoffwechselweg dereguliert oder lediglich die Enzymmenge gesteuert wird, sind nicht in der Lage sich kurzfristig auf sich ändernde Umweltbedingungen zu reagieren, mit der Folge, dass solche Zellen in dead zones stärker gestresst werden und damit die Produktivität des gesamten Bioprozesses abnimmt. Eine schnellere und dynamische Kontrolle der Stoffwechselwege, beispielsweise durch synthetische allosterische Regulation eines an der Überproduktion beteiligten Enzyms könnte daher hilfreich sein. Allerdings ist die Konstruktion und Nutzung eines solchen Enzyms kompliziert. Ein wichtiges Ziel dieser Arbeit war deren Konstruktion und Überprüfung, ob mit diesen Flüsse abhängig des gewünschten Effektors kontrolliert werden können. Da synthetische allosterische Enzyme als eine Art „Metabolisches Ventil“ in den von ihnen katalysierten Reaktionen agieren und wir diese in vivo charakterisieren wollen, war unser erstes Ziel das Schalten von metabolischen Ventilen an Engpässen im Stoffwechsel (sogenannte Metabolic Bottlenecks) zu untersuchen (Kapitel 3). Dazu haben wir das Wachstum und metabolische Profile von Wildtypisolaten und Laborstämmen analysiert und konnten zeigen, dass in Laborstämmen ein zuvor beschriebenes Bottleneck in der Pyrimidin-Biosynthese (verursacht durch zu geringe pyrE-Expressionsraten), dafür sorgt, dass der Fluss in den Stoffwechselweg so gering ist, dass letztlich sogar die Wachstumsrate verringert ist. Zusätzlich dazu haben wir CRISPR interference verwendet um 30 künstliche Bottlenecks in unterschiedliche Teile des metabolischen Netzwerks einzubringen. In 16 dieser Stämme mit einem solchen Bottleneck konnten wir erhöhte Substrat- und/oder reduzierte Produktkonzentrationen feststellen, die auf ein erfolgreich eingefügtes Bottleneck hindeuten. Allerdings konnten wir nur in 6 dieser 16 Stämme auch eine reduzierte Wachstumsrate feststellen, was unterstreicht, dass der Einfluss metabolischer Bottlenecks auf die zelluläre Fitness von der Stärke des Bottlenecks sowie der Reaktion, in die das Bottleneck eingeführt wurde, abhängig ist. Im zweiten Teil haben wir dann zwei Methoden evaluiert, mit denen synthetische allosterische Enzyme konstruiert werden können und welche beide auf dem Konzept der gerichteten Evolution basieren, nämlich „Split Proteins“ (Kapitel 4) und „Domain Insertion“ (Kapitel 5). Mit Hilfe des Split Protein-Ansatzes waren wir in der Lage, zwei Fragmente der Dihydrofolatreduktase (DHFR) mit den konditionell interagierenden Proteinen FRAP und FKBP12 zu verbinden, resultierend in einem Rapamycin-abhängigen metabolischem Enzym, das zur Kontrolle des Folat-Biosynthese und letztlich der Wachstumsrate genutzt werden kann. Mit dem Domain Insertion-Ansatzes konnten wir Chimere aus metabolischen Enzymen – 2-isopropylmalate-Synthase (LeuA) bzw. DHFR – und dem Maltose-bindenden Protein MBP als regulatorischer Domäne bilden. Wir waren in der Lage funktionelle Proteine zu identifizieren, die ausreichend katalytische Aktivität haben um Deletionsmutanten zu komplementieren. Allerdings konnten is jetzt keine Varianten gefunden werden, die sensitiv zum Effektor Maltose sind. Das Domain Insertion-Protokoll haben wir dahingehend optimiert, dass nun Stammbibliotheken, bestehend aus tausenden Stämmen, die potentiell Maltose-abhängige Enzymvarianten exprimieren können, hergestellt werden können, sodass eine Hochdurchsatzmethode zur Identifikation der interessanten Stämme benötigt wurde. Im dritten Teil haben wir daher das Fluoreszenzprotein TIMER, das als Einzelzell-Wachstumssensor verwendet werden kann, für seine Verwendung in E. coli und im Besonderen zur Anreicherung langsam wachsender Zellen aus einer großen Stammbibliothek evaluiert (Kapitel 6). Die darauf aufbauende Anreicherungsmethode soll in Zukunft dafür verwendet werden, Stämme mit Enzymvarianten, die mit Domain Insertion hergestellt wurden und in welche synthetische allosterische Regulation erfolgreich implementiert wurde, zu identifizieren und anzureichern.
In metabolic engineering strains are created that overproduce a certain product. For that, the production pathway is often released from any transcriptional, translational and post-translational regulation, resulting in a high abundance of enzymes in the production pathway and enzyme variants with feedback-resistance. However, complete dysregulation has several disadvantages: the pathway cannot respond to internal and external perturbations and metabolism of the host is overloaded, resulting in a lowered cellular fitness and reduced growth rates. To circumvent this problem, it is desirable to implement new layers of regulation in the metabolic network and in particular in the overproduction pathway. So far, such regulation has usually been implemented by controlling enzyme abundance. Two-phase processes for instance are dividing a bioprocess in two phases, a growth phase in which a sufficient amount of biomass is accumulated, and a production phase. In this second phase, the expression of enzymes needed for overproduction is induced, often in combination with the introduction of metabolic bottlenecks in competing pathways. However, the regulation of enzyme abundances does not allow fast response at the second or minute time-scale. Especially in large-scale bioreactors fast response is important, because of fluctuating availabilities of nutrients and oxygen caused by insufficient mixing which leads to the formation of microenvironments and dead-zones. Cells in which the overproduction pathway is either dysregulated or regulated only by implemented control of enzyme abundance are not able to adjust their metabolic networks according to fast changing microenvironments, leading to stressed and therefore unproductive strains which might negatively affect the stability and durability of bioprocesses. This highlights the need for faster acting dynamic control of metabolic pathways, for example through enzymes with synthetic allosteric regulation. However, the creation and usage of such enzymes is very challenging. A major goal of this work was to create such enzymes with synthetic allosteric regulation and to test their ability to control fluxes through their pathway. Synthetic allosteric enzymes are ‘metabolic valves’ that implement bottlenecks in the reaction they are catalyzing and we sought to characterize functioning of these valves in vivo. Therefore, our first goal was to examine functioning of these valves, resulting metabolic bottlenecks and their impact on the general fitness (Chapter 3). For that, we analyzed growth and metabolic profiles of wildtype isolate and laboratory strains and could show that in laboratory strains a previously reported bottleneck caused by low pyrE gene expression causes insufficient fluxes through the pyrimidine biosynthesis pathway and subsequently lowered growth rates. In addition to that, we used CRISPR interference to introduce artificial bottlenecks in 30 reactions in different parts of the metabolic network. In 16 of the resulting 30 strains we were able to detect elevated substrate or lowered product concentration, indicating a metabolic bottleneck. However, only 6 of these 16 strains also had a reduced growth rate, underlining that the impact of metabolic bottlenecks on the growth rate is generally dependent on the reaction and strength of the bottleneck. In the second part, we then evaluated two methods to create synthetic allosteric enzymes, both of which are based on the concept of directed evolution: Split Proteins (Protein Fragment Complementation, Chapter 4) and Domain Insertion (Chapter 5). With the Split Protein approach we were able to couple two fragments of a split dihydrofolate reductase (DHFR) to the conditionally interacting proteins FRAP and FKBP12, resulting in a rapamycin-dependent metabolic enzyme that can be used to control the folate biosynthesis pathway and consequently the growth rate. With the Domain Insertion approach, we created enzyme-regulatory domain chimera consisting of 2-Isopropylmalate synthase (LeuA) and murine DHFR as enzymes and the maltose binding protein MBP as regulatory domain. We isolated functional proteins, but could so far not identify a variant that is sensitive to the effector. We optimized the protocol to an extent that libraries of thousands of strain variants expressing potentially switching enzymes can be generated and the screening for strains of interest became the limiting factor. In a third part of this work we therefore evaluated the fluorescent single cell growth rate reporter TIMER for its utilization in E. coli and especially to enrich slow growing cells out of large genetic variant strain libraries in a high-throughput manner using fluorescence-activated cell sorting (Chapter 6). The herewith developed enrichment method is planned to be applied in the future to strain libraries created with the Domain Insertion library approach. |